实验流程

1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS。

2. 按比例加入适量预冷的RIPA 缓冲液。

3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4°C，缓慢晃动（EP管插冰上，置水平摇床上）。

4. 4°C离心后，立即将上清转移到一个新的离心管中。

5. 准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠。

6. 按比例加入Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10min（EP管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景。

7. 4°C离心后，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A珠子。

8. 用BCA法测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）。

9. 用PBS将总蛋白稀释到合适浓度。

10. 加入一定体积的预先稀释的一抗。

11. 4°C缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育。

12. 加入Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4°C缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h。

13. 瞬时离心5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的洗液（或PBS）洗3遍。

14. 将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min变性。

------------------------------------------------

样品要求

新鲜的样本材料（组织、细胞或蛋白溶液）；用于免疫沉淀的一抗（或由我司代购）及待测蛋白的相关信息

------------------------------------------------

交付结果

Western blot检测图，完整的实验报告，以及相应的结果及分析