TUNEL检测：基因组DNA断裂时，暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 的催化下加上荧光素 (FITC) 标记的dUTP (fluorescein-dUTP) ，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测，这就是TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling) 法检测细胞凋亡的原理。

冰冻切片tunel实验步骤

1、 冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分，冷丙酮固定10min，待丙酮完全干后于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

2、 修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K储存液用PBS 1:9稀释）覆盖组织，37度温箱孵育30min。将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

3、 破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

4、 加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1 (TdT) 和试剂2(dUTP)按2:29混合（试剂1,2为现配现用），加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。

5、 阻断内源性过氧化物酶：将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片放入用甲醇配制的3%过氧化氢溶液（过氧化氢：甲醇=1:9）室温避光孵育15 min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

6、 加试剂3：切片稍甩干后，每张切片加适量试剂3(converter-POD）覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃温箱孵育30min。将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

7、 DAB显色：切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为细胞核呈棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。

8、 复染细胞核：Harris苏木素复染3min左右，自来水洗，1%的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，氨水返蓝，流水冲洗。

9、 脱水封片：将切片依次放入75%酒精6min-85%酒精6min --无水乙醇Ⅰ6min -无水乙醇Ⅱ6min -二甲苯Ⅰ5min 中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。

石蜡切片tunel实验步骤

1、 石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-蒸馏水洗。(冬天适当延长脱蜡时间）

2、 修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K储存液用PBS 1:9稀释）覆盖组织，37度温箱孵育30min。将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

3、 破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

4、 加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1 (TdT) 和试剂2(dUTP)按2:29混合（试剂1,2为现配现用），加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。

5、 阻断内源性过氧化物酶：将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片放入用甲醇配制的3%过氧化氢溶液（过氧化氢：甲醇=1:9）室温避光孵育15 min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

6、 加试剂3：切片稍甩干后，每张切片加适量试剂3(converter-POD）覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃温箱孵育30min。将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

7、 DAB显色：切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为细胞核呈棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。

8、 复染细胞核：Harris苏木素复染3min左右，自来水洗，1%的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，氨水返蓝，流水冲洗。

9、 脱水封片：将切片依次放入75%酒精6min-85%酒精6min --无水乙醇Ⅰ6min -无水乙醇Ⅱ6min -二甲苯Ⅰ5min 中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。

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